EHD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407060-ACT

Humanes EHD1 (Eps15-homologiedomänenhaltiges Protein 1) kodiert eine ATPase der EHD-Proteinfamilie, die das endozytotische Membran-Remodeling und das Recycling internalisierter Rezeptoren zurück zur Plasmamembran koordiniert. EHD1 reguliert den Transport aus tubulären Endosomen und steht in Wechselwirkung mit Rab-vermitteltem Transport, Aktin-Dynamik und phosphoinositidabhängiger Membrankrümmung, wodurch es die Rezeptorverfügbarkeit und die Dauer von Signalwegen beeinflusst. Über die Kontrolle des Cargo-Recyclings wirkt EHD1 auf Prozesse wie Zellmigration, Nährstoffaufnahme sowie die Oberflächenexpression von Adhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktor-Rezeptoren. Veränderte Programme des endozytotischen Recyclings und des Rezeptortransports unter Beteiligung von EHD1 wurden mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für proliferative Signalgebung und invasives Verhalten in der Krebsbiologie relevant sind, sowie mit einer umfassenderen Dysregulation des Membrantransports in komplexen Krankheitskontexten.

EHD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EHD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EHD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EHD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EHD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EHD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EHD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EHD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EHD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EHD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.