Plasmide CRISPR d'Activation (h) EDG-2: sc-402843-ACT

Le gène humain LPAR1 code EDG-2, un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) sensible à l’acide lysophosphatidique (LPA), qui s’accouple principalement à Gαi, Gαq et Gα12/13 pour réguler les voies MAPK/ERK, PI3K–AKT, PLC–Ca2+ ainsi que le remodelage du cytosquelette dépendant de Rho/ROCK. Par ces voies, EDG-2 influence la migration, l’adhésion, la prolifération et la survie cellulaires, ainsi que les interactions avec la matrice extracellulaire, intégrant les signaux de médiateurs lipidiques dans le remodelage tissulaire et les réponses inflammatoires. L’activité de LPAR1 est fréquemment étudiée dans des contextes où la signalisation du LPA façonne la communication stroma–système immunitaire, la fonction de barrière vasculaire et épithéliale, et l’activation des fibroblastes. Une signalisation dérégulée d’EDG-2 a été associée dans la littérature à l’invasion liée au cancer, au remodelage fibrotique et à des processus neuro-inflammatoires, ce qui en fait un nœud pertinent pour la dissection mécanistique des voies de signalisation.

EDG-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LPAR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EDG-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LPAR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LPAR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EDG-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LPAR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EDG-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EDG-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de LPAR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.