EB1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401367-ACT

Das humane MAPRE1 kodiert das Endbindungsprotein 1 (EB1), einen zentralen Plus-End-Tracking-Faktor von Mikrotubuli, der die Mikrotubulidynamik mit kortikalem Einfangen, dem Aufbau der mitotischen Spindel und der Chromosomensegregation koordiniert. EB1 interagiert mit APC und anderen +TIP-Proteinen, um Mikrotubuliwachstum, Zellpolarität und intrazellulären Transport zu regulieren, und verknüpft so den Umbau des Zytoskeletts mit der Zellzykluskontrolle. Eine Fehlregulation von MAPRE1/EB1 wurde mit veränderter mitotischer Genauigkeit, Aneuploidie und invasivem Zellverhalten in Verbindung gebracht, was es für die Untersuchung von Signalwegen relevant macht, die proliferativen und migratorischen Phänotypen zugrunde liegen. Seine zentrale Rolle in mikrotubuliabhängigen Prozessen unterstützt zudem mechanistische Forschung zur Zentrosomenfunktion und zur Regulation des Spindelkontrollpunkts.

EB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAPRE1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAPRE1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAPRE1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EB1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAPRE1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EB1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EB1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAPRE1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.