Plasmide CRISPR d'Activation (h) E2F-4: sc-400851-ACT

E2F4 code le facteur de transcription humain E2F-4, un régulateur clé de l’expression des gènes du cycle cellulaire qui agit généralement avec les protéines DP et les répresseurs de la famille RB pour contrôler la transition de la phase G0/G1 vers la phase S. E2F-4 participe à des complexes de type DREAM et à des complexes associés aux protéines « pocket », qui coordonnent la répression et l’activation programmée de gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, la progression mitotique et le contrôle des points de contrôle. Par son rôle dans la signalisation proliférative et les programmes de différenciation, une activité modifiée d’E2F4 peut contribuer à une dérégulation du contrôle du cycle cellulaire, à l’instabilité génomique et à des états transcriptionnels oncogènes. Les réseaux transcriptionnels dépendants d’E2F-4 sont donc largement étudiés en biologie du cancer, en sénescence et dans des contextes développementaux où la sortie du cycle cellulaire et la réentrée sont étroitement régulées.

E2F-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de E2F4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

E2F-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus E2F4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription E2F4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de E2F-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus E2F4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de E2F-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie E2F-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de E2F4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.