Plasmide CRISPR d'Activation (h) Dyrk1A: sc-401928-ACT

DYRK1A code la kinase 1A à double spécificité régulée par phosphorylation sur tyrosine (Dyrk1A), une sérine/thréonine kinase qui module des programmes de phosphorylation des protéines régissant la progression du cycle cellulaire, la différenciation neuronale et la fonction synaptique. Dyrk1A s’intègre à des réseaux de signalisation qui contrôlent la régulation transcriptionnelle, l’épissage de l’ARN et la protéostasie, avec des substrats rapportés et des liens avec des voies influençant l’état de la chromatine et les réponses au stress. Des altérations de la dose et de l’activité de DYRK1A sont impliquées dans des phénotypes neurodéveloppementaux, notamment des effets sensibles au dosage associés à la trisomie 21 et à la biologie liée aux troubles du spectre de l’autisme, et ont également été étudiées dans des contextes de prolifération de cellules cancéreuses. Ces caractéristiques font de DYRK1A un nœud utile pour disséquer des circuits régulateurs pilotés par des kinases dans des modèles cellulaires humains.

Dyrk1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DYRK1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dyrk1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DYRK1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DYRK1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dyrk1A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DYRK1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dyrk1A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dyrk1A dans les cellules tumorales présentant une expression de DYRK1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.