DRP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400459-ACT

DNM1L kodiert das dynaminverwandte Protein 1 (DRP1), eine große GTPase, die die Spaltung (Fission) von Mitochondrien und Peroxisomen orchestriert, indem sie sich an Organellmembranen anlagert und diese in Zusammenarbeit mit Adapterproteinen wie MFF, MID49/51 und FIS1 einschnürt. Über die Kontrolle der Organellmorphologie beeinflusst DRP1 die Bioenergetik, die Mitophagie, die Apoptose-Signalgebung sowie die Umverteilung von Mitochondrien während der Zellteilung und des neuronalen Transports. Die DRP1-Aktivität ist in Stressantwort-Signalwege eingebunden und wird durch Phosphorylierung, SUMOylierung, Ubiquitinierung und S‑Nitrosylierung reguliert, wodurch zelluläre Signalprozesse mit der mitochondrialen Dynamik verknüpft werden. Eine fehlregulierte DNM1L/DRP1-Funktion wird mit neuroentwicklungsbedingten und neurodegenerativen Phänotypen, kardiometabolischen Störungen sowie krebsassoziiertem metabolischem Remodeling in Verbindung gebracht und macht DRP1 zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien der mitochondrialen Homöostase.

DRP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DNM1L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DRP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DNM1L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DNM1L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DRP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DNM1L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DRP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DRP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DNM1L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.