Plasmide CRISPR d'Activation (m) DOCK 7: sc-426491-ACT

Dock7 code DOCK7, un facteur d’échange de nucléotides guanine atypique qui active préférentiellement des GTPases de la famille Rho telles que RAC1 et CDC42 afin de coordonner le remodelage du cytosquelette d’actine, la polarité cellulaire et la migration dirigée. Dans le système nerveux de la souris, DOCK7 contribue à la différenciation neuronale, à la croissance axonale et à la biologie des cellules de Schwann via des réseaux de signalisation qui couplent les signaux membranaires à la dynamique du cytosquelette. Ces fonctions placent DOCK7 au sein de voies régissant l’extension des neurites et la myélinisation, avec une pertinence plus large pour la neurobiologie du développement et les programmes de motilité cellulaire. Une activité altérée de DOCK7 a été associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et a été étudiée dans des contextes où une signalisation des GTPases Rho dérégulée affecte la morphogenèse tissulaire et la formation des circuits neuronaux.

DOCK 7 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Dock7 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DOCK 7 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Dock7 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Dock7, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DOCK 7. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Dock7 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DOCK 7 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DOCK 7 dans les cellules tumorales présentant une expression de Dock7 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.