DOCK 2 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-430116-ACT-2

Nel topo, Dock2 codifica DOCK2, un fattore di scambio di nucleotidi della guanina (GEF) a espressione ristretta alle cellule ematopoietiche che attiva le GTPasi Rac per controllare il rimodellamento del citoscheletro di actina e la migrazione direzionale in linfociti, neutrofili e altre cellule immunitarie. DOCK2 agisce a valle dei recettori per le chemochine e della segnalazione del recettore dell’antigene, coordinando l’adesione integrina-dipendente, la formazione della sinapsi immunologica e il traffico attraverso i tessuti linfoidi tramite vie che collegano la segnalazione PI3K alla regolazione delle GTPasi della famiglia Rho. L’alterazione genetica o funzionale di DOCK2 è associata a risposte immunitarie innate e adattative compromesse ed è stata implicata, in sistemi sperimentali, in fenotipi infiammatori e simil-autoimmuni, maggiore suscettibilità alle infezioni e modifiche della sorveglianza immunitaria antitumorale. L’editing del gene Dock2 nel topo supporta studi meccanicistici sulla motilità leucocitaria, la chemiotassi e la riscrittura delle reti di segnalazione, consentendo analisi cellula-immunitaria–intrinseche in modelli di infiammazione, interazioni ospite–patogeno e ricerca in immuno-oncologia.

DOCK 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dock2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DOCK 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dock2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dock2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DOCK 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dock2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DOCK 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DOCK 2 nelle cellule tumorali con espressione di Dock2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.