Plásmido CRISPR de Activación (m) Dnmt2: sc-420034-ACT

Trdmt1 codifica Dnmt2, una metiltransferasa de citosina-5 conservada evolutivamente que metila principalmente tRNAs específicos (en particular en C38) más que el ADN genómico, lo que favorece la integridad del tRNA, la fidelidad de decodificación y la adaptación celular al estrés. Mediante la regulación de la metilación del ARN, Dnmt2 se cruza con vías de procesamiento de ARN y control de la traducción que influyen en la proteostasis y en las respuestas de crecimiento. La actividad alterada de TRDMT1/DNMT2 se ha relacionado con programas desregulados de metilación de ARN asociados con la biología tumoral, las respuestas a infecciones virales y fenotipos celulares relacionados con el estrés. En sistemas murinos, Trdmt1 proporciona un modelo manejable para analizar mecanismos epitranscriptómicos que acoplan la modificación del ARN a transiciones de estado celular y a la estabilidad del genoma.

Dnmt2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Trdmt1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Dnmt2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Trdmt1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Trdmt1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Dnmt2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Trdmt1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Dnmt2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Dnmt2 en células tumorales con expresión de Trdmt1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.