Plásmido CRISPR de Activación (h) Dnmt1: sc-400272-ACT

DNMT1 codifica la ADN (citosina-5)-metiltransferasa 1 (Dnmt1), la principal metiltransferasa de mantenimiento que copia los patrones de metilación de CpG en las hebras de ADN nacientes durante la fase S. Mediante interacciones con UHRF1, PCNA y la maquinaria de cromatina acoplada a la replicación, Dnmt1 conserva la memoria epigenética y favorece la estabilidad del genoma, la impronta y la inactivación del cromosoma X. La actividad de DNMT1 modela los programas transcripcionales a través del diálogo cruzado con las modificaciones de histonas y la remodelación de la cromatina, influyendo en la identidad y la diferenciación celulares. La función desregulada de DNMT1 y la metilación aberrante del ADN se asocian con la reprogramación epigenética oncogénica, respuestas alteradas de reparación del ADN y fenotipos del neurodesarrollo, lo que la convierte en un objetivo central para estudios mecanísticos del mantenimiento del epigenoma.

Dnmt1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DNMT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Dnmt1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DNMT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DNMT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Dnmt1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DNMT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Dnmt1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Dnmt1 en células tumorales con expresión de DNMT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.