Plásmido CRISPR de Activación (m) DNA pol ζ: sc-422655-ACT

Rev3l codifica la subunidad catalítica de la polimerasa de ADN ζ (pol ζ), una polimerasa especializada de la familia B esencial para la síntesis de ADN por translesión y la tolerancia a lesiones que bloquean la replicación. En células de ratón, la pol ζ coopera con REV1 y con PCNA modificado por ubiquitina dentro de la respuesta al daño del ADN para extender desde extremos de cebador con desajustes o dañados, favoreciendo la progresión de la horquilla de replicación bajo estrés genotóxico. Esta actividad influye en las tasas de mutagénesis y en la estabilidad del genoma, vinculando las vías reguladas por Rev3l con mecanismos que determinan la acumulación de mutaciones durante la carcinogénesis y con la sensibilidad celular a agentes que dañan el ADN. Dado que la función de Rev3l se cruza con la señalización del estrés replicativo y con la elección de vías de reparación, se estudia ampliamente en modelos de inestabilidad genómica, diversificación inmunitaria y viabilidad del desarrollo.

DNA pol ζ El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Rev3l sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DNA pol ζ El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Rev3l en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Rev3l, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DNA pol ζ. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Rev3l y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DNA pol ζ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DNA pol ζ en células tumorales con expresión de Rev3l silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.