DNA pol γ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401870-ACT

POLG kodiert die DNA-Polymerase γ, die wichtigste replizierende Polymerase in Mitochondrien, die in Zusammenarbeit mit der TWNK-Helikase und dem mitochondrialen Einzelstrang-DNA-Bindeprotein die Replikation und Reparatur der mitochondrialen DNA (mtDNA) übernimmt. Durch die Aufrechterhaltung der mtDNA-Kopienzahl und der Genomintegrität unterstützt die DNA-Polymerase γ die oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Biogenese und die Nukleotidhomöostase. Störungen der POLG-Funktion werden mit mtDNA-Depletion und der Anhäufung von Deletionen in Verbindung gebracht und verknüpfen so mitochondriale Genominstabilität mit neuromuskulären und neurodegenerativen Krankheitsphänotypen. Da mitochondriale Dysfunktion Apoptose, angeborene Immun-Signalwege und den Zellstoffwechsel beeinflusst, wird POLG häufig in Signalwegen untersucht, die die Bioenergetik mit Stressantworten koppeln.

DNA pol γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLG-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLG-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLG-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol γ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLG-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol γ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol γ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLG-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.