Plásmido CRISPR de Activación (h) DNA pol ε A: sc-402290-ACT

POLE codifica la subunidad catalítica A de la ADN polimerasa ε, una polimerasa replicativa de alta fidelidad esencial para la síntesis de ADN de la cadena líder y la progresión de la fase S. La ADN polimerasa ε participa en la estabilidad de la horquilla de replicación, se coordina con el complejo helicasa CMG y contribuye a la corrección de pruebas intrínseca (actividad exonucleasa 3′→5′) que limita los errores de replicación. A través de su papel en la replicación del ADN y el mantenimiento del genoma, POLE se integra con la señalización de la respuesta al daño del ADN y con las vías de estrés replicativo que protegen la integridad cromosómica. Las alteraciones en la función o la regulación de POLE se asocian con una mayor carga mutacional y fenotipos de inestabilidad genómica, aspectos que se investigan con frecuencia en estudios sobre defectos de replicación asociados al cáncer y la dependencia de la reparación del ADN.

DNA pol ε A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de POLE sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DNA pol ε A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus POLE en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional POLE, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DNA pol ε A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo POLE y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DNA pol ε A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DNA pol ε A en células tumorales con expresión de POLE silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.