Plásmido CRISPR de Activación (h) DNA pol β: sc-402861-ACT

POLB codifica la ADN polimerasa beta (ADN pol β), una enzima clave en la vía de reparación por escisión de bases (BER) que rellena brechas de un solo nucleótido y participa en la reparación de parche corto tras la eliminación de bases dañadas. La ADN pol β actúa en sitios de daño oxidativo y por alquilación, coordinándose con XRCC1, la ligasa de ADN III y APE1 para mantener la estabilidad del genoma durante la replicación y en células no proliferativas. La alteración de la expresión o la actividad de POLB se ha asociado con un aumento de la carga mutacional, inestabilidad cromosómica y respuestas anómalas al daño del ADN observadas en múltiples tipos de cáncer y en modelos de enfermedades neurodegenerativas. Como factor central de la BER, POLB se estudia con frecuencia en el contexto de la señalización del estrés genotóxico, la reparación asociada a la replicación y los mecanismos de resistencia a agentes que dañan el ADN en sistemas basados en células.

DNA pol β El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de POLB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DNA pol β El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus POLB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional POLB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DNA pol β. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo POLB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DNA pol β en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DNA pol β en células tumorales con expresión de POLB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.