Plásmido CRISPR de Activación (h) Dkk-4: sc-406386-ACT

El DKK4 humano codifica la proteína relacionada con Dickkopf 4 (Dkk-4), un modulador secretado de la señalización Wnt que influye en la transcripción dependiente de β-catenina y en programas posteriores que controlan la proliferación, la diferenciación y la organización del tejido epitelial. Al interactuar con los correceptores de Wnt y ajustar la salida de la vía, Dkk-4 puede modificar las decisiones de destino celular y las respuestas de remodelación en contextos del desarrollo y en el adulto. La expresión desregulada de DKK4 se ha asociado con una actividad alterada de la vía Wnt en múltiples escenarios relevantes para la enfermedad, incluida la biología tumoral y la fibrosis tisular, donde los cambios en el equilibrio de la señalización afectan la invasión, los fenotipos tipo célula madre y las interacciones con el microambiente. Como nodo de la vía, DKK4 se estudia con frecuencia por su papel en la comunicación cruzada con la señalización de factores de crecimiento y en la regulación de gradientes de señalización extracelular.

Dkk-4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DKK4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Dkk-4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DKK4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DKK4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Dkk-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DKK4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Dkk-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Dkk-4 en células tumorales con expresión de DKK4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.