Plásmido CRISPR de Activación (h) DGK-ζ: sc-403843-ACT

La diacilglicerol quinasa zeta (DGKζ), codificada por el gen humano **DGKZ**, fosforila el diacilglicerol (DAG) para generar ácido fosfatídico, determinando la amplitud y la duración de la señalización dependiente de DAG. Al modular el equilibrio de segundos mensajeros, DGKζ influye en vías relacionadas con PKC y Ras/ERK, en la señalización proximal al receptor y en programas de remodelación del citoesqueleto que afectan a la activación, migración y proliferación celular. La actividad de DGKζ también se vincula al metabolismo de los fosfoinosítidos y a la integración de señales aguas abajo de receptores inmunitarios y de estímulos de factores de crecimiento. La desregulación de la señalización DAG–ácido fosfatídico en la que participa DGKζ se ha implicado en estudios de disfunción inmunitaria, inflamación y contextos de señalización oncogénica, lo que respalda su relevancia como un nodo mecanístico en la investigación de la señalización celular.

DGK-ζ El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DGKZ sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DGK-ζ El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DGKZ en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DGKZ, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DGK-ζ. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DGKZ y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DGK-ζ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DGK-ζ en células tumorales con expresión de DGKZ silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.