Plásmido CRISPR de Activación (h) DENND5B: sc-414817-ACT

DENND5B codifica una proteína que contiene un dominio DENN, implicada en la regulación del tráfico de membranas dependiente de las GTPasas Rab, ayudando a coordinar la gemación de vesículas, el transporte endosomal y la señalización compartimentalizada. Al influir en el ciclo de las pequeñas GTPasas y en la clasificación de la carga, DENND5B puede afectar el recambio de receptores, la localización intracelular de proteínas y procesos celulares más amplios como la polaridad y la proliferación. La expresión alterada o la disrupción de reguladores del tráfico como DENND5B se ha asociado con redes de señalización desreguladas y con cambios genómicos/funcionales observados en diversos contextos de enfermedad humana, incluidos fenotipos relacionados con el cáncer. Como resultado, DENND5B se estudia con frecuencia en vías que vinculan la dinámica del sistema endomembranoso con el control del estado celular y la adaptación al estrés.

DENND5B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DENND5B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DENND5B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DENND5B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DENND5B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DENND5B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DENND5B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DENND5B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DENND5B en células tumorales con expresión de DENND5B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.