Delta Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400790-ACT

Il gene umano DLL1 codifica il ligando canonico di Notch di tipo Delta-like 1 (Delta), un ligando ancorato alla membrana che si lega ai recettori NOTCH per innescare la scissione proteolitica e il rilascio del dominio intracellulare di Notch, regolando così programmi trascrizionali che controllano le decisioni di destino cellulare. La segnalazione Notch mediata da DLL1 è fondamentale per il patterning embrionale, la neurogenesi, la somitogenesi e il mantenimento dei compartimenti di cellule staminali e progenitrici, attraverso la modulazione di differenziamento, proliferazione e inibizione laterale. Alterazioni dell’attività dell’asse DLL1/Notch sono state associate a una disregolazione dell’omeostasi tissutale e a disturbi dello sviluppo, e vengono frequentemente studiate in contesti di segnalazione aberrante nella biologia dei tumori, nell’angiogenesi e nella differenziazione delle cellule immunitarie. In quanto nodo della via di segnalazione alla superficie cellulare, DLL1 rappresenta un bersaglio maneggevole per analizzare le dinamiche della segnalazione juxtacrina e le risposte trascrizionali a valle.

Delta Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DLL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Delta Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DLL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DLL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Delta. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DLL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Delta nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Delta nelle cellule tumorali con espressione di DLL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.