Plásmido CRISPR de Activación (h) DDB2: sc-401686-ACT

El gen humano **DDB2** codifica un factor de reconocimiento de daño en el ADN que forma el complejo **UV-DDB** con **DDB1**, actuando aguas arriba de la ligasa ubiquitina E3 **CUL4A–RBX1** para iniciar la reparación por escisión de nucleótidos (NER) a nivel de genoma global. Al unirse a los dímeros de pirimidina ciclobutano inducidos por UV y a los fotoproductos 6-4, DDB2 favorece la verificación de la lesión, la remodelación de la cromatina y el reclutamiento de componentes NER posteriores, respaldando así la estabilidad del genoma y las respuestas de control del ciclo celular. La actividad de DDB2 se cruza con la proteostasis mediada por ubiquitina y con las vías de reparación del ADN acopladas a la transcripción, influyendo en la sensibilidad celular al estrés genotóxico. La regulación alterada de DDB2 se ha asociado con una capacidad deficiente de reparación del ADN y con la acumulación de mutaciones relevantes para la biología del cáncer y fenotipos relacionados con la fotosensibilidad, lo que lo convierte en una diana útil para estudios mecanísticos de la señalización del daño en el ADN.

DDB2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DDB2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DDB2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DDB2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DDB2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DDB2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DDB2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DDB2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DDB2 en células tumorales con expresión de DDB2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.