Plásmido CRISPR de Activación (h) DDB1: sc-402067-ACT

El DDB1 humano codifica la proteína 1 de unión al daño del ADN, un adaptador central de los complejos de ligasa E3 de ubiquitina CUL4–DDB1 que coordinan el recambio dependiente de ubiquitina de factores asociados a la cromatina. DDB1 participa en la reparación por escisión de nucleótidos y en el mantenimiento más amplio del genoma al acoplar el reconocimiento del daño por UV con la remodelación de la cromatina, las respuestas al estrés de replicación y la proteostasis en horquillas de replicación detenidas. Mediante la regulación de la progresión del ciclo celular y de la capacidad de reparación del ADN, una actividad alterada de DDB1 puede influir en la inestabilidad genómica y en programas transcripcionales vinculados a la transformación oncogénica y a otros trastornos proliferativos. Su posición central en la señalización por ubiquitina convierte a DDB1 en un nodo útil para estudiar la elección de vías de reparación del ADN, la dinámica de la cromatina acoplada a la replicación y la remodelación del epigenoma adaptativa al estrés.

DDB1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DDB1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DDB1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DDB1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DDB1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DDB1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DDB1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DDB1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DDB1 en células tumorales con expresión de DDB1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.