DDB1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402067-ACT

Human DDB1 kodiert das DNA-Schadensbindungsprotein 1, einen zentralen Adapter der CUL4–DDB1-E3-Ubiquitinligase-Komplexe, die den ubiquitinabhängigen Abbau chromatinassoziierter Faktoren koordinieren. DDB1 ist an der Nukleotid-Exzisionsreparatur und der umfassenderen Genomstabilisierung beteiligt, indem es die Erkennung von UV-Schäden mit Chromatin-Remodeling, Replikationsstressantworten und der Proteostase an gestauten Replikationsgabeln koppelt. Durch die Regulation der Zellzyklusprogression und der DNA-Reparaturkapazität kann eine veränderte DDB1-Aktivität genomische Instabilität und Transkriptionsprogramme beeinflussen, die mit onkogener Transformation und anderen proliferativen Erkrankungen verknüpft sind. Aufgrund seiner zentralen Stellung in der Ubiquitin-Signalgebung ist DDB1 ein nützlicher Knotenpunkt zur Untersuchung der Wahl von DNA-Reparaturwegen, der replikationsgekoppelten Chromatindynamik und der stressadaptiven Umgestaltung des Epigenoms.

DDB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DDB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DDB1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DDB1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DDB1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.