DDAH II Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403032-ACT

O DDAH2 humano codifica a dimetilarginina dimetilaminohidrolase II (DDAH II), uma enzima citosólica que hidrolisa a dimetilarginina assimétrica (ADMA) e a L-NMMA em citrulina e dimetilamina, regulando assim a atividade da óxido nítrico sintase e a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO). Por meio do controle do metabolismo das metilargininas, a DDAH II integra-se à sinalização endotelial, a processos sensíveis ao estado redox e a vias de homeostase vascular que influenciam o tônus do músculo liso e a sinalização inflamatória. Alterações na expressão ou na atividade de DDAH2 têm sido associadas à sinalização de NO prejudicada e a fenótipos de disfunção endotelial. Esses mecanismos tornam o DDAH2 um alvo relevante para o estudo de respostas ao estresse cardiometabólico, inflamação vascular e programas celulares dependentes de NO em sistemas modelo humanos.

DDAH II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DDAH2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDAH II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DDAH2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DDAH2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDAH II. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DDAH2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDAH II no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDAH II em células tumorais com expressão de DDAH2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.