Plasmide CRISPR d'Activation (h) DcR3: sc-404980-ACT

TNFRSF6B code le récepteur leurre 3 (DcR3), un membre soluble de la superfamille des récepteurs du TNF qui se lie au ligand de Fas (FASLG), à LIGHT (TNFSF14) et à TL1A (TNFSF15) afin de moduler la signalisation apoptotique extrinsèque et les interactions croisées inflammatoires. En séquestrant ces ligands, DcR3 peut remodeler la signalisation des récepteurs de mort, influencer les programmes d’activation immunitaire liés à NF-κB et affecter l’équilibre entre survie cellulaire et mort cellulaire programmée. L’activité de DcR3 a été associée à l’échappement immunitaire, à des réponses des cellules T modifiées et à des changements de la signalisation du microenvironnement dépendante des cytokines dans de multiples contextes pathologiques. Ces propriétés font de TNFRSF6B une cible utile pour étudier la biologie des ligands de la famille TNF, la régulation de l’apoptose et les voies liées à l’inflammation dans des modèles cellulaires humains.

DcR3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFRSF6B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DcR3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFRSF6B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFRSF6B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DcR3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFRSF6B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DcR3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DcR3 dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFRSF6B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.