Plasmide CRISPR d'Activation (h) DAT/Dopamine Transporter/SLC6A3: sc-400391-ACT

SLC6A3 code le transporteur de la dopamine (DAT), un symporteur présynaptique de la membrane plasmique qui élimine la dopamine de la fente synaptique par recapture dépendante du Na⁺/Cl⁻, modulant ainsi le tonus dopaminergique et la durée du signal. Le DAT régule le recyclage vésiculaire et l’homéostasie de la dopamine dans les circuits nigrostriés et mésocorticolimbiques, influençant le traitement de la récompense, la locomotion et les fonctions exécutives. Des altérations de l’expression de SLC6A3 ou de l’activité du transporteur ont été associées à une neurotransmission dopaminergique dérégulée, impliquée dans des contextes de recherche neuropsychiatrique et neurodégénérative, notamment des phénotypes liés à l’attention, la biologie de l’usage de substances et la vulnérabilité des voies parkinsoniennes. Le DAT interagit également avec des programmes de trafic et de phosphorylation dépendants des kinases, qui contrôlent sa localisation membranaire et sa capacité de recapture.

DAT/Dopamine Transporter/SLC6A3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC6A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DAT/Dopamine Transporter/SLC6A3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC6A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC6A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DAT/Dopamine Transporter/SLC6A3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC6A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DAT/Dopamine Transporter/SLC6A3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DAT/Dopamine Transporter/SLC6A3 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC6A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.