D930020B18Rik CRISPR Activation Plasmid (m): sc-432083-ACT

D930020B18Rik kodiert ein Mausprotein, das bislang nur unvollständig charakterisiert ist, und die verfügbaren Annotationen sprechen eher für eine Rolle in der grundlegenden zellulären Homöostase als für ein spezifisches, gut kartiertes Signalmodul. Als exprimierter Genlokus wird es häufig in transkriptomischen und funktionell-genomischen Studien berücksichtigt, in denen die Modulation schlecht annotierter Gene Beiträge zur Transkriptionsregulation, RNA-Prozessierung oder zum Proteinumsatz aufdecken kann. Eine veränderte Expression nicht charakterisierter RIKEN-cDNAs wird in krankheitsrelevanten Kontexten wie Proliferation, Differenzierung und zellulären Stressantworten häufig als Begleitphänomen beobachtet, was seine Eignung als Ziel für explorative Untersuchungen unterstützt. Die Untersuchung von D930020B18Rik kann helfen, Gen-Netzwerkmodelle zu verfeinern und über phänotypisches Profiling sowie Multi-Omics-Integration Verknüpfungen zwischen Signalwegen zu identifizieren.

D930020B18Rik Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen D930020B18Rik-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

D930020B18Rik Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des D930020B18Rik-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der D930020B18Rik-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen D930020B18Rik-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native D930020B18Rik-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von D930020B18Rik-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des D930020B18Rik-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem D930020B18Rik-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.