D4DR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402947-ACT

Das humane DRD4-Gen kodiert den Dopaminrezeptor D4 (D4DR), einen Gi/o-gekoppelten GPCR, der die Aktivität der Adenylatcyclase, die cAMP/PKA-Signalübertragung und nachgeschaltete Phosphorylierungsprogramme moduliert, die die neuronale Erregbarkeit und die synaptische Transmission prägen. D4DR bindet zudem MAPK- und β-Arrestin-gekoppelte Signalwege ein und beeinflusst dadurch Rezeptordesensibilisierung, Trafficking sowie längerfristige transkriptionelle Antworten auf den dopaminergen Tonus. Die Expression von DRD4 und regulatorische Variationen wurden im Kontext der Funktion frontostriataler Schaltkreise und neuropsychiatrischer Phänotypen untersucht, was es zu einem nützlichen molekularen Knotenpunkt für die Erforschung der Dynamik dopaminerger Signalübertragung macht. In Zellmodellen kann eine Perturbation von DRD4 genutzt werden, um die Kopplung von Signalwegen, die Rezeptorpharmakologie und transkriptionelle Antworten auf Dopamin in relevanten neuronalen sowie heterologen Expressionssystemen zu untersuchen.

D4DR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DRD4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

D4DR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DRD4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DRD4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen D4DR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DRD4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von D4DR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des D4DR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DRD4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.