Plásmido CRISPR de Activación (h) Cytokeratin 5: sc-400671-ACT

KRT5 codifica la citoqueratina 5, una proteína de filamento intermedio de tipo II que se empareja con la queratina 14 para formar la red de queratinas basales en epitelios estratificados. La citoqueratina 5 contribuye a la estabilidad mecánica, a la arquitectura de la adhesión célula–célula y a las respuestas epiteliales al estrés, y se regula de forma dinámica durante la diferenciación de los queratinocitos, la reparación de heridas y el mantenimiento del destino de las células basales. La alteración de la expresión de KRT5 o de la organización de los filamentos de queratina se asocia con fenotipos de fragilidad epitelial y se evalúa con frecuencia en estudios de programas epiteliales de tipo basal y de estados de linaje tumoral. Como eje estructural, la citoqueratina 5 se integra funcionalmente con la remodelación del citoesqueleto y con vías de señalización vinculadas a la adhesión que influyen en la proliferación y la integridad de la barrera.

Cytokeratin 5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KRT5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cytokeratin 5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KRT5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KRT5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cytokeratin 5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KRT5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cytokeratin 5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cytokeratin 5 en células tumorales con expresión de KRT5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.