Plasmide CRISPR d'Activation (h) cystatin B: sc-403769-ACT

CSTB code la cystatine B (stéfine B), un inhibiteur intracellulaire des protéases à cystéine qui freine l’activité des cathepsines et contribue au maintien de la protéostasie lors d’un stress lysosomal et du renouvellement des protéines cytoplasmiques. En limitant les dommages médiés par les protéases, la cystatine B participe à l’homéostasie des neurones et des cellules immunitaires, en influençant la susceptibilité à l’apoptose, les réponses au stress oxydatif et la signalisation inflammatoire. Des altérations de l’expression ou de la fonction de CSTB ont été associées à des phénotypes neurodégénératifs et neuroinflammatoires, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de l’équilibre protéase–antiprotéase et de la vulnérabilité cellulaire. CSTB est aussi utilisé comme gène modèle pour explorer l’impact de la régulation intracellulaire des protéases sur le traitement des antigènes et les voies d’adaptation au stress.

cystatin B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CSTB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cystatin B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CSTB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CSTB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cystatin B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CSTB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cystatin B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cystatin B dans les cellules tumorales présentant une expression de CSTB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.