CYP46 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419926-ACT

Das Mausgen **Cyp46a1** kodiert die Cholesterin-24-Hydroxylase (CYP46A1/CYP46), ein im Gehirn angereichertes Cytochrom-P450-Enzym, das die Umwandlung von Cholesterin zu **24S-Hydroxycholesterin** katalysiert und dadurch den Cholesterinumsatz sowie den Efflux über die Blut-Hirn-Schranke unterstützt. Diese Reaktion verknüpft die neuronale Sterolhomöostase mit umfassenderen Netzwerken des Lipidstoffwechsels, einschließlich der Oxysterol-Signalgebung und der Regulation einer cholesterinabhängigen Membranzusammensetzung, die die synaptische Funktion beeinflusst. Eine veränderte CYP46A1-Aktivität ist mit Störungen des Cholesteringleichgewichts im Gehirn verbunden und wurde im Kontext neurodegenerativer und kognitiver Phänotypen untersucht, bei denen eine Sterolfehlregulation mit Neuroinflammation und Proteostase-Signalwegen zusammenwirkt.

CYP46 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cyp46a1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP46 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cyp46a1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cyp46a1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP46-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cyp46a1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP46-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP46-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cyp46a1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.