Plásmido CRISPR de Activación (h2) CYP3A4: sc-416463-ACT-2

El CYP3A4 humano codifica una monooxigenasa principal del citocromo P450 localizada principalmente en el retículo endoplásmico, que cataliza el metabolismo oxidativo de diversos xenobióticos y sustratos endógenos, incluidos esteroides e intermediarios de los ácidos biliares. Su expresión y actividad se regulan mediante vías de señalización de receptores nucleares como PXR (NR1I2) y CAR (NR1I3), lo que vincula a CYP3A4 con programas hepáticos de desintoxicación, la homeostasis redox y mecanismos de interacción fármaco–fármaco. La variación interindividual impulsada por polimorfismos genéticos y por la transcripción inducible contribuye a una capacidad metabólica alterada y se ha asociado con susceptibilidad a reacciones adversas a medicamentos y a fenotipos relacionados con el hígado en estudios farmacogenómicos. La edición genética de CYP3A4 permite construir modelos celulares isogénicos para investigar la función enzimática, los elementos reguladores y las respuestas de las redes metabólicas, así como cuantificar los efectos sobre el aclaramiento de xenobióticos y el metabolismo de esteroides en sistemas relevantes para humanos.

CYP3A4 El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CYP3A4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CYP3A4 El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CYP3A4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CYP3A4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CYP3A4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CYP3A4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CYP3A4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CYP3A4 en células tumorales con expresión de CYP3A4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.