cylindromatosis 1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428814-ACT

Das Mausgen **Cyld** kodiert Cylindromatose 1, ein deubiquitinierendes Enzym, das bevorzugt K63- und M1-verknüpfte Ubiquitin-Ketten entfernt, um die Signalweiterleitung aus rezeptorproximalen Komplexen abzuschwächen. CYLD wirkt als negativer Regulator der NF-κB- und MAPK-Signalübertragung nachgeschaltet an TNF-Rezeptoren, Toll-like-Rezeptoren und Antigenrezeptor-Signalwegen und beeinflusst dadurch entzündliche Transkriptionsprogramme, das Zellüberleben und Stressantworten. Es trägt außerdem zur Zytoskelettdynamik und zu mikrotubulusabhängigen Prozessen bei und prägt damit Zellmigration und Gewebeorganisation. Eine dysregulierte CYLD-Aktivität oder -Expression ist mit aberranter Immun-Signalgebung und Tumorbiologie verknüpft, was CYLD zu einem wertvollen Knotenpunkt für die Untersuchung der ubiquitinabhängigen Kontrolle von Signalnetzwerken macht.

cylindromatosis 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cyld-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cylindromatosis 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cyld-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cyld-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cylindromatosis 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cyld-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cylindromatosis 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cylindromatosis 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cyld-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.