Plásmido CRISPR de Activación (h) cyclin E2: sc-402500-ACT

CCNE2 codifica la ciclina E2, una ciclina reguladora que se une y activa a CDK2 para promover la transición G1/S y el inicio de la replicación del ADN. La ciclina E2 integra señales mitogénicas con el control de los puntos de control del ciclo celular al modular la fosforilación de sustratos aguas abajo implicados en el disparo de los orígenes de replicación y la entrada en fase S. La expresión desregulada de CCNE2 puede alterar la estabilidad del genoma y las respuestas al estrés replicativo, por lo que es relevante en estudios de señalización proliferativa, tolerancia al daño del ADN y programas transcripcionales asociados al ciclo celular. Por ello, CCNE2 se utiliza ampliamente como una herramienta molecular para interrogar redes impulsadas por CDK2, la temporización del ciclo celular y los mecanismos que acoplan el control de la replicación a modelos de transformación oncogénica.

cyclin E2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CCNE2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cyclin E2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CCNE2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CCNE2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cyclin E2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CCNE2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cyclin E2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cyclin E2 en células tumorales con expresión de CCNE2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.