Plasmide CRISPR d'Activation (m) CTH: sc-430767-ACT

Le gène **Cth** de la souris code la cystathionine γ-lyase (CTH), une enzyme dépendante du phosphate de pyridoxal de la voie de transsulfuration, qui convertit la cystathionine en cystéine, α-cétobutyrate et ammoniac, et contribue à la production cellulaire de sulfure d’hydrogène (H₂S). En régulant la disponibilité de la cystéine et le tamponnement rédox, CTH influence le métabolisme du glutathion, les réponses au stress oxydant, la fonction mitochondriale et l’homéostasie métabolique. Des altérations de l’activité de CTH ont été associées à des perturbations du métabolisme des acides aminés soufrés et à une signalisation dépendante de l’H₂S, en interaction avec des voies inflammatoires, la biologie vasculaire et la neurobiologie. Par conséquent, CTH est fréquemment étudiée dans des modèles de stress oxydant, de dysfonction métabolique et de lésions tissulaires afin de clarifier comment les flux de soufre modulent l’état cellulaire et les réseaux de signalisation.

CTH Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cth sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CTH Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cth dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cth, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CTH. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cth natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CTH au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CTH dans les cellules tumorales présentant une expression de Cth silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.