Plasmide CRISPR d'Activation (m) CSN8: sc-430844-ACT

Mouse Cops8 code pour CSN8, une sous-unité centrale du signalosome COP9 qui coordonne l’activité des ligases ubiquitine culline‑RING via la régulation de l’état de neddylation des cullines. En modulant la protéostasie dépendante de l’ubiquitine, CSN8 influence la progression du cycle cellulaire, les réponses aux dommages de l’ADN et des programmes de signalisation d’adaptation au stress qui croisent les voies de l’autophagie et de l’inflammation. Une altération de la fonction du signalosome COP9 a été associée à une dérégulation du renouvellement des protéines et du contrôle transcriptionnel dans des modèles d’homéostasie tissulaire ainsi que dans des processus neurodégénératifs et oncogéniques. Cops8 est donc largement utilisé pour étudier comment la dynamique du système ubiquitine–protéasome façonne la fidélité de la signalisation et la viabilité cellulaire in vivo et dans des cellules murines cultivées.

CSN8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cops8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CSN8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cops8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cops8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CSN8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cops8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CSN8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CSN8 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cops8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.