CRHSP-24 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406630-ACT

CARHSP1 codifica a CRHSP-24, uma fosfoproteína regulada por cálcio que integra a sinalização dependente de Ca2+/calmodulina com o controlo pós-transcricional da expressão génica. A CRHSP-24 tem sido associada à modulação da estabilidade e da tradução de mRNA através de interações com complexos de proteínas de ligação a RNA, o que a enquadra em vias que ajustam as respostas celulares ao stress e a síntese proteica acoplada a estímulos. Enquanto substrato de regulação dependente de fosforilação, oferece um ponto de entrada mecanístico para estudar como redes de cinases e fosfatases remodelam programas de expressão génica. A desregulação da sinalização do cálcio e do metabolismo de RNA é uma característica recorrente em fenótipos associados à inflamação, disfunção metabólica e cancro, tornando o CARHSP1 um nó molecular relevante para investigação focada em vias.

CRHSP-24 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CARHSP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CRHSP-24 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CARHSP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CARHSP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CRHSP-24. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CARHSP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CRHSP-24 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CRHSP-24 em células tumorais com expressão de CARHSP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.