CPS2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403519-ACT

Il CAD umano codifica un enzima multifunzionale che contiene il dominio carbamoil-fosfato sintetasi 2 (CPS2) e catalizza i passaggi impegnati e limitanti la velocità della biosintesi de novo delle pirimidine. Sostenendo la produzione di UTP e CTP, l’attività di CAD collega il metabolismo dei nucleotidi alla sintesi di DNA/RNA, alla progressione del ciclo cellulare e alle risposte allo stress replicativo, con una regolazione coordinata attraverso vie di segnalazione sensibili a fattori di crescita e nutrienti, come mTORC1 e la fosforilazione dipendente da MAPK. Le perturbazioni del flusso di pirimidine mediato da CAD possono influenzare la stabilità del genoma e i programmi trascrizionali nelle cellule a rapida proliferazione, rendendolo un nodo chiave per lo studio del controllo metabolico della proliferazione e dell’omeostasi degli acidi nucleici. Un metabolismo delle pirimidine deregolato e un’espressione alterata di CAD sono stati osservati in diversi contesti rilevanti per la malattia, inclusi il rimodellamento metabolico associato al cancro e disturbi neurometabolici ereditari, a supporto della sua utilità come bersaglio di ricerca focalizzato sulla via.

CPS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CAD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CPS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CAD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CAD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CPS2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CAD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CPS2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CPS2 nelle cellule tumorali con espressione di CAD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.