connexin 46 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403947-ACT

GJA3 codifica a conexina 46, uma proteína de junção comunicante (gap junction) enriquecida no cristalino que se organiza em hemicanais e canais intercelulares, permitindo a troca direta, célula a célula, de íons e metabólitos. Ao sustentar o acoplamento entre as fibras do cristalino, a conexina 46 ajuda a manter a homeostase iônica, o equilíbrio redox e a coordenação metabólica necessários para a transparência do cristalino. Alterações na função da conexina 46 prejudicam a comunicação via gap junction e estão associadas a fenótipos de catarata hereditária e a comprometimento da fisiologia do cristalino. Em modelos celulares, a atividade de GJA3 é comumente estudada no contexto do tráfego de membrana, do controle de abertura/fechamento (gating) dos canais e de vias responsivas ao estresse que influenciam a proteostase e o dano oxidativo.

connexin 46 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GJA3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

connexin 46 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GJA3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GJA3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de connexin 46. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GJA3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de connexin 46 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via connexin 46 em células tumorais com expressão de GJA3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.