Plásmido CRISPR de Activación (h) connexin 36: sc-402740-ACT

GJD2 codifica la conexina 36 (Cx36), una proteína de las uniones comunicantes (gap junctions) que se ensambla en canales intercelulares que permiten el acoplamiento eléctrico y metabólico directo entre células adyacentes. El acoplamiento mediado por Cx36 favorece la descarga sincronizada y las oscilaciones de red, especialmente en circuitos neuronales, al permitir un flujo iónico rápido y el intercambio de moléculas pequeñas a través de las membranas. En el sistema nervioso central y otros tejidos excitables, la conexina 36 influye en la integración sináptica, la propagación de señales y la plasticidad dependiente de la actividad mediante la regulación del ensamblaje y la compuerta (gating) de las uniones comunicantes. Las alteraciones en la expresión o en el acoplamiento de GJD2/conexina 36 se han implicado en disfunciones neurofisiológicas y se estudian en el contexto de trastornos que cursan con una sincronía neuronal deteriorada.

connexin 36 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GJD2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

connexin 36 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GJD2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GJD2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de connexin 36. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GJD2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de connexin 36 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía connexin 36 en células tumorales con expresión de GJD2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.