Plasmide CRISPR d'Activation (h) CLK2: sc-403326-ACT

La CLK2 humaine (CDC-like kinase 2) est une protéine kinase à double spécificité qui phosphoryle des facteurs d’épissage riches en motifs SR et coordonne la dynamique du spliceosome, reliant la maturation des pré-ARNm au contrôle transcriptionnel. L’activité de CLK2 contribue à des programmes d’épissage alternatif et s’articule avec la régulation du cycle cellulaire ainsi qu’avec des voies de signalisation sensibles au stress, notamment des voies influençant le métabolisme de l’ARN et la protéostasie. Une expression ou une signalisation de CLK2 dérégulée a été associée à des profils d’épissage altérés observés en oncologie et dans des contextes de maladies métaboliques, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques de la maturation de l’ARN. En tant que kinase régulatrice, CLK2 constitue un levier expérimental accessible pour disséquer comment des décisions d’épissage dépendantes de la phosphorylation remodèlent les réseaux d’expression génique en aval.

CLK2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CLK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CLK2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CLK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CLK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CLK2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CLK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CLK2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CLK2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CLK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.