claudin-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401284-ACT

CLDN4 kodiert Claudin-4, ein tetraspanendes Tight-Junction-Protein, das zur Ausbildung der epithelialen Barrierefunktion und der apiko-basalen Polarität beiträgt, indem es die parazelluläre Permeabilität für Ionen und gelöste Stoffe reguliert. Claudin-4 ist an der Assemblierung und dem Umbau von Tight Junctions beteiligt, unter anderem durch Interaktionen mit Gerüstproteinen wie Mitgliedern der ZO-Familie, wodurch junctionale Komplexe mit dem Aktin-Zytoskelett und Signalnetzwerken verknüpft werden, die Differenzierung und Gewebeorganisation beeinflussen. Eine veränderte CLDN4-Expression wird häufig in epithelialen Tumoren beobachtet und steht mit Änderungen der Zelladhäsion, Programmen im Zusammenhang mit der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) sowie invasivem Verhalten in Verbindung. Darüber hinaus wurde eine dysregulierte Tight-Junction-Zusammensetzung unter Beteiligung von Claudin-4 in entzündlichen und infektiösen Kontexten impliciert, in denen die Barriereintegrität beeinträchtigt ist.

claudin-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLDN4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

claudin-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLDN4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLDN4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen claudin-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLDN4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von claudin-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des claudin-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLDN4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.