Plásmido CRISPR de Activación (h) CKIP-1: sc-403898-ACT

PLEKHO1 codifica la proteína 1 que interactúa con la caseína quinasa 2 (CKIP-1), un adaptador que contiene un dominio de homología con pleckstrina, se localiza en la membrana plasmática y coordina interacciones proteína–proteína que controlan la transducción de señales y el recambio proteico. CKIP-1 se ha relacionado con la regulación de la señalización Akt/PI3K y de procesos dependientes de ubiquitina mediante interacciones con ligasas E3 y fosfatasas, influyendo así en el crecimiento celular, la diferenciación y la organización del citoesqueleto. En biología ósea, CKIP-1 está implicada en la función de los osteoblastos y en vías de formación ósea, mientras que estudios más amplios asocian una expresión alterada de PLEKHO1 con cambios en programas de proliferación y respuesta al estrés relevantes para el cáncer y contextos inflamatorios. Estas características hacen de PLEKHO1 un objetivo útil para desentrañar redes de señalización próximas a la membrana y programas transcripcionales que sustentan la homeostasis tisular.

CKIP-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PLEKHO1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CKIP-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PLEKHO1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PLEKHO1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CKIP-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PLEKHO1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CKIP-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CKIP-1 en células tumorales con expresión de PLEKHO1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.