citrate synthase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402227-ACT

Das humane Gen **CS** kodiert die Citrat-Synthase, ein Enzym der mitochondrialen Matrix, das die Kondensation von Oxalacetat und Acetyl‑CoA zu Citrat katalysiert und damit den Tricarbonsäurezyklus (TCA‑Zyklus) einleitet. Durch die Steuerung des Eintritts in den oxidativen Stoffwechsel unterstützt die Citrat-Synthase die ATP‑Produktion, anaplerotische Prozesse sowie die Bereitstellung von Citrat für die Lipid‑ und Cholesterinbiosynthese über den mitochondrial‑zytosolischen Kohlenstofffluss. Die CS‑Aktivität ist eng mit der mitochondrialen Biogenese, der Redox‑Homöostase und der metabolischen Anpassung unter Nährstoffstress verknüpft. Eine veränderte CS‑Expression oder eine gestörte Funktion des mitochondrialen TCA‑Zyklus wird häufig im Zusammenhang mit metabolischen Dysfunktionen und bioenergetischem Remodeling untersucht, wie es bei Neurodegeneration, kardiometabolischen Phänotypen und im Tumorstoffwechsel beobachtet wird.

citrate synthase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

citrate synthase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen citrate synthase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von citrate synthase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des citrate synthase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.