Chr-B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401478-ACT

CHGB kodiert Chromogranin B (Chr-B), ein saures Protein sekretorischer Granula, das in neuroendokrinen und neuronalen Zellen angereichert ist und die regulierte Sekretion sowie die Biogenese dichtkerniger Vesikel unterstützt. Chr-B ist an der Sortierung und Reifung der Granula-Fracht beteiligt und trägt so zur Effizienz der stimulusgekoppelten Exozytose sowie zur Freisetzung von Peptidhormonen/Neuropeptiden bei. Aufgrund seiner Funktionen in der Homöostase des sekretorischen Signalwegs wird CHGB häufig in Zusammenhängen untersucht, die neuroendokrine Differenzierung, die Funktion synapsenähnlicher Vesikel und calciumabhängige Signalwege im Zusammenhang mit Vesikeltransport betreffen. Veränderte CHGB-Expression oder -Prozessierung wurde bei Erkrankungen untersucht, die durch sekretorische Dysfunktion und neuroendokrines Ungleichgewicht gekennzeichnet sind, und bietet einen molekularen Ansatzpunkt für mechanistische Studien in krankheitsrelevanten Zellmodellen.

Chr-B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHGB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Chr-B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHGB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHGB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Chr-B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHGB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Chr-B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Chr-B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHGB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.