CHPT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-412745-ACT-2

O CHPT1 humano (colina fosfotransferase 1) codifica uma enzima associada ao retículo endoplasmático que catalisa a etapa final da biossíntese de fosfatidilcolina na via de Kennedy, transferindo fosfocolina do CDP-colina para o diacilglicerol. Ao regular a produção celular de fosfatidilcolina, o CHPT1 contribui para a biogênese de membranas, a dinâmica de gotículas lipídicas e a manutenção da composição das membranas de organelos, com efeitos a jusante no tráfego secretor e em respostas ao stress ligadas à homeostase lipídica. A perturbação do metabolismo da fosfatidilcolina está implicada em disfunção metabólica e fenótipos oncogénicos por meio da alteração de plataformas de sinalização de membrana e do remodelamento lipídico. Assim, o CHPT1 é um alvo útil para estudos de edição génica que investigam o fluxo de fosfolípidos, a biologia da membrana do RE e as relações entre genótipo e fenótipo em modelos de doenças associadas a lípidos.

CHPT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CHPT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CHPT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CHPT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CHPT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CHPT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CHPT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CHPT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CHPT1 em células tumorais com expressão de CHPT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.