Plasmide CRISPR d'Activation (h) Chk1: sc-400223-ACT

CHEK1 code la kinase sérine/thréonine Chk1, un effecteur central de la réponse aux dommages de l’ADN qui coordonne le contrôle des points de contrôle (checkpoints) de la phase S et de la transition G2/M. Activée principalement en aval d’ATR en réponse au stress de réplication et aux lésions de l’ADN simple brin, Chk1 phosphoryle des cibles qui régulent l’initiation de la réplication, la stabilité des fourches de réplication et la progression du cycle cellulaire, notamment les phosphatases CDC25 et des composants de la machinerie de réplication. Par ces voies, CHEK1 contribue à préserver l’intégrité du génome et à limiter l’accumulation d’aberrations chromosomiques. Une signalisation Chk1 dérégulée est fréquemment étudiée dans le contexte des troubles prolifératifs, du stress de réplication induit par des oncogènes et des mécanismes de résistance aux agressions génotoxiques.

Chk1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHEK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Chk1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHEK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHEK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Chk1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHEK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Chk1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Chk1 dans les cellules tumorales présentant une expression de CHEK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.