CHIP/STUB1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400815-ACT

STUB1 kodiert die E3-Ubiquitin-Ligase CHIP, einen Co-Chaperon, der über seine Tetratricopeptid-Repeat-(TPR)- und U-Box-Domänen die durch HSP70/HSP90 vermittelte Erkennung von Klientenproteinen mit einem ubiquitinabhängigen Proteinabbau koppelt. CHIP/STUB1 reguliert die Proteostase, indem es die Proteinqualitätskontrolle koordiniert, chaperonvermittelte Entscheidungen über das Refolding steuert und den Abbau über das Ubiquitin-Proteasom-System vermittelt – mit nachgeschalteten Effekten auf zelluläre Stressantworten sowie die Homöostase von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum (ER). Über diese Prozesse beeinflusst STUB1 Signalwege, die mit Proteinaggregation und der Aufrechterhaltung neuronaler Funktionen verknüpft sind; eine veränderte CHIP/STUB1-Aktivität wurde mit neurodegenerativen Phänotypen und ataxieassoziierten Krankheitsmechanismen in Verbindung gebracht. Seine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Belastung durch fehlgefaltete Proteine macht STUB1 zu einem geeigneten Knotenpunkt für die Untersuchung von Stresssignalwegen und Proteomstabilität in humanen Zellmodellen.

CHIP/STUB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen STUB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CHIP/STUB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des STUB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der STUB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CHIP/STUB1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native STUB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CHIP/STUB1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CHIP/STUB1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem STUB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.