Che-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404982-ACT

Humanes AATF kodiert Che-1, einen nukleären transkriptionellen Kofaktor, der an der Koordination des Zellzyklus-Fortschritts, der DNA-Schadenssignalgebung und apoptotischer Schwellenwerte beteiligt ist. Che-1 interagiert mit der Transkriptions- und Chromatin-Regulationsmaschinerie, um Expressionsprogramme zu modulieren, die mit p53-abhängigen Stressantworten und der durch RNA-Polymerase II vermittelten Transkription verknüpft sind. Über diese Funktionen trägt AATF zu zellulären Entscheidungen zwischen Proliferation und Checkpoint-Arrest bei, und seine Dysregulation wurde in krebsrelevanten Kontexten mit veränderter Überlebenssignalgebung und Phänotypen genomischer Instabilität in Verbindung gebracht. Die Aktivität von Che-1 wird zudem im Zusammenhang mit Proteostase und RNA-Metabolismus untersucht, was seinen Einsatz in mechanistischen Untersuchungen von Stressanpassungswegen unterstützt.

Che-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AATF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Che-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AATF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AATF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Che-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AATF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Che-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Che-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AATF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.