CHAC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403197-ACT

CHAC1 (ChaC glutathionspezifische Gamma-Glutamylcyclotransferase 1) ist ein stressinduzierbares Enzym, das Glutathion abbaut und damit die Redox-Homöostase mit dem Aminosäurestoffwechsel sowie der zellulären Anpassung an oxidativen Stress und Stress des endoplasmatischen Retikulums verknüpft. Als nachgeschalteter Effektor der durch ATF4 gesteuerten integrierten Stressantwort beeinflusst CHAC1 das Gleichgewicht reaktiver Sauerstoffspezies, die Proteinfaltungskapazität und die Anfälligkeit für stressassoziierte Programme der Zellschicksalsentscheidung. Eine veränderte CHAC1-Expression wurde in verschiedenen Kontexten metabolischen Stresses und von Entzündungen beschrieben, darunter in der Krebsbiologie und in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen, in denen Glutathion-Depletion und ferroptosebezogene Signalwege häufig untersucht werden. Die Modulation von CHAC1 bietet einen gut handhabbaren Ansatz, um zu erforschen, wie der Glutathion-Umsatz Signalnetzwerke, die mitochondriale Funktion und stressresponsive Transkriptionsprogramme in humanen Zellen verändert.

CHAC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHAC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CHAC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHAC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHAC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CHAC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHAC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CHAC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CHAC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHAC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.