Cdc34 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403783-ACT

CDC34 kodiert das humane E2-Ubiquitin-konjugierende Enzym Cdc34, eine zentrale Komponente der SCF-(SKP1–CUL1–F-Box)-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexe, die die Polyubiquitinierung regulatorischer Proteine für den proteasomalen Abbau katalysieren. Die Aktivität von Cdc34 ist eng mit der Zellzyklusprogression verknüpft, insbesondere mit der G1/S-Kontrolle, indem sie den Umsatz wichtiger Substrate fördert, die die DNA-Replikation und die Checkpoint-Signalgebung regulieren. Über seine Rolle in der ubiquitinabhängigen Proteostase ist CDC34 mit Signalwegen verbunden, die Proliferation, Genomstabilität und Stressantworten steuern. Eine veränderte CDC34-Expression oder eine Dysregulation der SCF-Achse wird häufig im Kontext onkogener Signalwege und anderer Erkrankungen untersucht, die durch abweichende Programme des Proteinabbaus gekennzeichnet sind.

Cdc34 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDC34-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdc34 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDC34-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDC34-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdc34-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDC34-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdc34-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdc34-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDC34-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.