CD77 synthase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404828-ACT

A4GALT kodiert die CD77-Synthase, eine im Golgi-Apparat lokalisierte Glykosyltransferase, die die Addition von Galaktose an Lactosylceramid katalysiert und dadurch Globotriaosylceramid (Gb3/CD77) bildet, ein wichtiges neutrales Glycosphingolipid. Durch die Steuerung der Glycosphingolipid-Biosynthese beeinflusst die CD77-Synthase die Organisation von Membran-Mikrodomänen, den Proteintransport (Trafficking) sowie Prozesse der Zell-Zell-Erkennung, die für die Biologie von Immun- und Epithelzellen relevant sind. Veränderte A4GALT-Aktivität und veränderte CD77/Gb3-Mengen wurden mit Änderungen des Differenzierungszustands und der Anfälligkeit für glykanabhängige Interaktionen in Verbindung gebracht, einschließlich Signalwege, die in der B-Zell-Biologie und bei tumorassoziierten Glykosylierungsphänotypen eine Rolle spielen. Daher wird A4GALT häufig im Zusammenhang mit dem Glycosphingolipidstoffwechsel, dem Remodeling des Glykoms und der Regulation von Zelloberflächenantigenen untersucht.

CD77 synthase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen A4GALT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD77 synthase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des A4GALT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der A4GALT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD77 synthase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native A4GALT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD77 synthase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD77 synthase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem A4GALT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.