Plasmide CRISPR/Cas9 KO CD74 (m2): sc-421073-KO-2

Présentation

Cd74 code CD74, également appelée chaîne invariante du CMH de classe II, une protéine membranaire de type II qui chaperonne les complexes CMH II α/β du réticulum endoplasmique vers les compartiments endosomaux afin d’y permettre le chargement en peptides. CD74 régule le traitement et la présentation des antigènes dans les cellules présentatrices d’antigène professionnelles, et son clivage protéolytique favorise l’échange du CLIP et la sélection du répertoire peptidique. Au-delà du trafic intracellulaire, CD74 peut participer à des voies de signalisation immunitaires via des interactions avec des partenaires de surface, influençant l’activation des lymphocytes B, les réponses des macrophages et des programmes géniques inflammatoires. Une présentation antigénique et une signalisation dépendantes de CD74 dérégulées ont été impliquées dans des mécanismes de maladies auto-immunes et inflammatoires, et sont fréquemment utilisées comme paramètres de lecture en recherche sur l’immunologie, l’infection et le microenvironnement tumoral.

Le CD74 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m2) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène Cd74 dans les lignées cellulaires mouse. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus Cd74, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le CD74 plasmide HDR (m2) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible Cd74 défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide CD74 CRISPR/Cas9 KO (m2):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert Cd74.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus Cd74 et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons Cd74 essentiels à la fonction CD74
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.